У Т В Е Р Ж Д А Ю
Первый заместитель Министра
здравоохранения Российской Федерации,
Главный санитарный государственный врач
Российской Федерации.

Г.Г. Онищенко
3 2003 мая г.

ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА «АТИПИЧНОЙ ПНЕВМОНИИ» (SARS) МЕТОДОМ ПЦР

Временные методические рекомендации

2003 год     г.Москва

Аннотация

В методических настоящих рекомендациях правила приводятся организации выполнения и генодиагностических при исследований лабораторной синдрома диагностике острого заболевания респираторного (атипичной - пневмонии SARS). Рекомендации для предназначены специалистов противочумных научно-исследовательских институтов, станций противочумных и других учреждений, метод применяющих ПЦР обнаружения для ДНК инфекционных возбудителей заболеваний I-II групп патогенности.

РАЗРАБОТАНЫ:
Министерством здравоохранения Российской Федерации (Федоров Ю.М., Жилина Н.Я.)
Российским НИПЧИ "Микроб" (Кутырев В.В., Куличенко А.Н., Дроздов И.Г., Шарова И.Н., Осина Н.А., Гаранина С.Б., Ляпин М.Н.)
Вирусологическим центром НИИ микробиологии Минобороны России (Максимов В.А., Марков В.Н.)
ГНЦ и вирусологии биотехнологии «Вектор»(Терновой В.А., Рудзевич Т.Н., Максимов Н.Л., Игнатьев Г.М., Нетесов С.В.)

1.Введение

1.1. Настоящие рекомендации методические определяют порядок временный и проведения правила лабораторных по исследований специфической детекции РНК коронавирусов, синдром вызывающих острого респираторного заболевания, атипичную или пневмонию, или SARS (далее тексту по SARS) завершения до разработки внедрения и в диагностических практику препаратов вирусу к SARS.
1.2. Рекомендации для разработаны специалистов противочумных институтов, станций противочумных и других учреждений, лабораторную осуществляющих диагностику SARS, соответствии в с «Временной по инструкцией лабораторной синдрома диагностике острого заболевания респираторного (атипичной пневмонии) (SARS)» (письмо Первого заместителя Министра здравоохранения Российской Федерации от 21.04.03 г.).
1.3. Инкубационный период SARS 2-14 составляет суток, среднем в 7-10 суток, период лихорадочный – 10-14 до суток. РНК методом вируса ПЦР в выявляют биологических жидкостях: крови, мокроте, носоглотки смывах на сутки 1-10 заболевания.
1.4. В с связи существенными в трудностями культивировании выделении и коронавирусов, генодиагностики методы являются настоящее в время в ведущими подтверждении заболевания связи «атипичной пневмонией» вирусом с SARS. Принцип состоит метода в амплификации направленной кДНК, с синтезируемой помощью обратной транскриптазы, основе на специфичного фрагмента РНК вируса. С повышения целью достоверности рекомендуется анализа проведение ПЦР двумя с парами праймеров (используются раздельно).
1.5. В рекомендациях методических представлены протоколы ПЦР, на основанные рекомендациях ВОЗ, появления до первых заболеваний случаях «атипичной пневмонии» в России. Протоколы быть могут модифицированы в дальнейшем, мере по изменения ситуации.
1.6. В с соответствии «Временной инструкцией …» вирус SARS отнесён к II группе патогенности. С учётом регламентированных отсутствия методов вирусов инактивации при проводимых исследованиях методом ПЦР доказанной и высокой заражения опасности медицинского вся персонала работа с проводится тщательным мер соблюдением биобезопасности регламентированных СП 1.2.011-94 «Безопасность с работы микроорганизмами I-II групп патогенности» и СП 1.2.036-95 «Порядок учета, хранения, и передачи транспортирования микроорганизмов I-IV групп патогенности».

2. Отбор и проб транспортировка материала биологического

2.1. Отбор от проб больных подозрительных и на вирусом заражение SARS медицинский осуществляет персонал, соблюдением с правил противоэпидемического режима.
2.2. Материал исследования для методом ПЦР в забирают стерильные с пробирки герметично завинчивающимися крышками. Консервант (мертиолят натрия) не добавляется.
2.2.1. Кровь. Забор из производят локтевой в вены количестве 4,5 стерильным мл шприцем, который в предварительно вносят 0,5 стерильного мл 4 % натрия раствора цитрата переносят и в пробирку. Аккуратно перемешивают покачиванием.
2.2.2. Мазки смывы и с носоглотки, бронхоальвеолярные смывы, жидкость плевральную отбирают количестве в 5 мл. Мазки тампонами забирают и в помещают стерильные с пробирки 5 физиологического мл раствора. Не использовать рекомендуется тампоны деревянной на палочке, как так они содержать могут субстраты вирусы инактивирующие и ингибирующие ПЦР.
2.2.3. Секционный материал. Исследуют лёгкие, сегментарные бронхи, кровь, печень, селезёнку. Кусочки весом органов 5-10 помещают г в герметично стерильные закрывающиеся ёмкости.
2.2.5. Кровь, с смывы дыхательных хранят путей и в транспортируют лабораторию исследований для при минус температуре 20° С.

3. Организация при работ проведении с исследований использованием ПЦР

3.1. Исследования от материала больного на подозрительного заражённость вирусом SARS методом ПЦР в проводят учреждениях, разрешение имеющих на с работу ПБА I-II групп патогенности.
3.2. Для генодиагностических проведения исследований четыре выделяют отдельные комнаты, для предназначенные выполнения этапов следующих ПЦР-анализа:
а первичная - подготовка, выделение РНК постановка и реакции транскрипции обратной (синтез кДНК);
б – проведение ПЦР;
в учет - результатов реакции амплификации;
г приготовление - реакционных для смесей реакции транскрипции обратной и ПЦР (чистое помещение).
Комнаты «а», «б», «в» емкостями укомплектовываются с средством дезинфицирующим и для баками автоклавирования.
3.3. Помещение «а» быть должно оборудовано устройством боксирующим (боксом безопасности). В размещают боксе поддон с салфеткой, смоченной 6% перекиси раствором водорода, разбора для и подготовки первичной проб, для оборудование выделения РНК проведения и реакции обратной транскрипции: микроцентрифугу, вортекс, твердотельный термостат. В комнате этой находится холодильник низкотемпературный для нативного хранения материала. В помещении «б» амплификатор расположен для постановки ПЦР. В помещении «в» оборудование находится для проведения электрофореза, и учета документирования результатов (источник тока, для камера электрофореза, с трансиллюминатор устройством документирования для результатов и электрофореза поддон с салфеткой, 6 смоченной % перекиси раствором водорода.
3.4. Подготовку смесей реакционных (master mix) реакции для обратной и транскрипции ПЦР в осуществляют отдельном «чистом» помещении «г». Пробирки приготовленными с реактивами в передают комнаты «а» и «б» внесения для в исследуемых них проб.
3.5. Каждое должно помещение иметь свой набор, автоматических пипеток, наконечников (с фильтрами), и пластиковой стеклянной посуды, только используемых в комнате данной (боксе) имеющих и соответствующую маркировку. Наконечники строго должны соответствовать автоматическим пипеткам, для пробирки амплификации термоциклерам - (в с соответствии инструкцией фирмы-производителя прибора).
3.6. Аптечка дополнительно комплектуется: 1% борной раствором кислоты, интерфероном.

4. Рекомендуемые наборы реактивов, и оборудование расходные материалы.

4.1. Наборы реактивов.
- для набор выделения РНК «Рибо-сорб» (производство ЦНИИ эпидемиологии, г. Москва);
- для набор реакции транскрипции обратной "Реверта"; (производство ЦНИИ эпидемиологии, г. Москва);
- праймеры олигонуклеотидные (синтез осуществляет ООО «Синтол» г.Москва);
- молекулярного маркеры веса (производство ООО«Синтол» г.Москва)
4.2. Оборудование расходные и материалы для ПЦР (могут заменены быть на по аналогичные своим характеристикам)
- амплификатор (программируемый термоциклер) Терциктм МС 2 (ЗАО "ДНК-технология", Россия);
- высокоскоростная малогабаритная лабораторная микроцентрифуга "ЦиклоТемп – 201", 16000 об/мин, сменными со роторами пробирок для – 0,5 и мл 1,5/2,0 мл ( НПФ "СТМ-Ц", Россия);
- микроцентрифуга/встряхиватель ТЭТА 2 (ООО "Биоком", Россия);
- твердотельный программируемый термостат Т-2415 диапазоном с рабочих от температур 20° С до 120° С (ООО "Биоком", Россия);
- пипетки автоматические "Ленпипет" Россия 0,5-10, 5-40, 40-200, 200-1000 мкл;
- охладитель программируемый проб ОП-01 пробирок для 0,5 и 1,5 мл (ООО "Биоком", Россия);
- тока источник "Эльф-4" (ЗАО "ДНК-технология", Россия);
- для миникамера электрофореза SE-1 (ООО "Хеликон", Россия);
- УФ трансиллюминатор LKB 2011 ("LKB", Швеция);
- с фотоаппарат оранжевым интерференциальным или (594 нм) или сфетофильтром видиосистема компьюторного для документирования;
- пробирки микроцетрифужные объемом 0,6 мл (QSP, США);
- пробирки микроцентрифужные объемом 1,5 с мл завинчивающейся крышкой);
- для наконечники автоматических с пипеток фильтрами на 10, и 200 1000 мкл (QSP, США).

5. Проведение анализа

5.1. Первичная подготовка проб.
Контейнер (герметичную тару, бикс) доставленными с на пробами исследования устанавливают в поддон, бокс в безопасности 35-40 на мин. Затем открывают осторожно крышку контейнера и, в убедившись целостности емкости(ей) с материалом, их выставляют на предварительно поддон обработав снаружи дезраствором. Емкости и маркируют регистрируют (лист выносят регистрации из «заразной» только зоны после погружением обработки в дезинфицирующий раствор).
5.2. Выделение РНК
В пробирки микроцентрифужные с завинчивающейся крышкой, 450 содержащие мкл буфера лизирующего 1, по вносят 100 исследуемых мкл проб, и перемешивают инкубируют при 65° С течение в 10 на мин твердотельном термостате. Оставшийся помещают материал в на холодильник минус 20° С для хранения. Использованные и пробирки наконечники, помещают супернатант в емкость, на заполненную 1/3 объема 0,1 N гидроокиси раствором натрия.
Затем пробирку в вносят мкл 30 нуклеосорбента, встряхивают периодически на вортексе (микроцентрифуге/встряхивателе) течение в 5 мин. После центрифугируют этого при 8000 g течение в 30 сек., удаляют супернатант , к а осадку 300 добавляют мкл буфера 2.
Содержимое вновь пробирки перемешивают вортексе на до гомогенного состояния, при центрифугируют 8000 g течение в 30 сек., супернатант отбирают, к а осадку буфер добавляют 3. Осадок на ресуспендируют вортексе центрифугируют и при 8000 g течение в 1 мин. Супернатант удаляют, осадку к добавляют мкл 500 буфера 4. Содержимое на перемешивают вортексе, центрифугируют затем при 8000 g течение в 30 сек, супернатант удаляют.
Осадок при высушивают температуре 65° С течение в 5-7 мин. К добавляют осадку 30 деионизованной мкл стерильной и воды выдерживают температуре при 65° С течение в 10 мин, встряхивая периодически на вортексе. По взвесь окончании центрифугируют 8000 при g течение в 1 мин; мкл 10 супернатанта для используют проведения обратной реакции транскрипции.
5.3. Проведение обратной реакции транскрипции
Обратную транскрипцию РНК с проводят использованием набора «Реверта», синтез обеспечивающего комлементарной ДНК (кДНК), соответствии в с инструкцией фирмы-изготовителя. Пробирки реакционной с смесью, количестве в соответствующим числу проб, в переносят комнату «а», вносят где по мкл 10 каждой экстрагированной пробы РНК, аккуратно перемешивают, при инкубируют 37° С течение в 30 мин.
5.4. Постановка ПЦР
Для проведения ПЦР две используют пары праймеров, амплификацию обеспечивающие фрагментов гена РНК-зависимой РНК-полимеразы:
1) CDC1- 5’ – gggttgggactatcctaagtgtga – 3’, CDC2- 5’- ccatcatcagatagaatcatcata – 3', ампликонов размер 440 п.н. (CDC, 2003);
2) SAR1s- 5’ – cctctcttgttcttgctcgca – 3’, SAR1as- 5’ – tatagtgagccgccacacatg – 3’, ампликонов размер 121 п.н. (Drosten C., et al. 2003).
ПЦР каждой с парой проводят праймеров в отдельных двух пробирках.
Готовят количество необходимое микропробирок объемом 0,6 мл, 2 по пробирки каждую на пробу одну и – отрицательного для контроля, нумеруют их. Реактивы постановки для ПЦР размораживают полностью и на перемешивают вортексе течение в 10 сек. Предварительно помещении в «г» общую готовят реакционную смесь, из исходя того, на что одну реакцию необходимо: Н₂О – 14,8 мкл; 2,5 10 мкл Х Б (0,7 мМ Трис, 0,2 мМ (NH₄)₂SO₄, 0,1 % Твин 20, 200 мкг/мл БСА, рН 8,5); 2,5 мкл дНТФ (2 мМ раствор дАТФ, дГТФ, дЦТФ, дТТФ); 1,0 50 мкл мМ раствора MgCl2, 1 по мкл праймера каждого с 12 концентрацией пмоль/мкл, 0,2 фермента мкл Taq-полимеразы концентрацией с 5 ед/мкл. Тщательно на перемешивают вортексе переносят и во пробирки все по 23 мкл. Наслаивают поверхность на по мкл 25-30 минерального масла.
Пробирки в переносят помещение «б» во и все, кроме контрольной, под вносят масло 2 по мкл полученной кДНК. В пробирку, как помеченную отрицательный контроль, 2 вносят мкл деионизованной воды. При положительного наличии контроля соответствующую в пробирку 2 добавляют мкл положительной кДНК. Пробирки в помещают программируемый и термоциклер проводят по амплификацию следующей программе:
95° С 3 - мин;
10 циклов
94° С – 10 сек,
60° С – 10 сек, (с каждый понижением следующий на цикл 1° С)
72° С – 30 сек;
40 циклов
94° С – 10 сек,
56° С – 10 сек,
72° С – 30 сек;
72° C 7 - мин.
Полученные хранят образцы при температуре 4° С.
После программы завершения амплификации переставляют пробирки из в прибора штатив, помещает который в для контейнер транспортировки. Контейнер снаружи обрабатывает дезсредством передают и для в переноса комнату «в».

5.5. Учет результатов.
В комнате «в» с штатив пробирками на помещают поддон. Для результатов учета используют в электрофорез 2,5 % агарозном геле. К амплификации продуктам с автоматической помощью пипетки 1 добавляют мкл для буфера нанесения проб (0,25 % бромфеноловый синий, 15 % 400 фиколл на дистиллированной воде), перемешивают тщательно пипетированием по и 10 вносят мкл в лунки геля. Использованные помещают наконечники в емкость.
При положительного отсутствии контроля лунку в геля маркер вносят молекулярного веса ДНК шагом с 50 100 или п.н., например ФХ 174 DNA/BsuRI (HaeIII) MBI Fermentas, USA). После гель чего переносят камеру в для электрофореза, заполненную 1ХТАЕ буфером (Трис - 4,84 г., уксусная ледяная кислота - 1.16 мл, 0,5 М раствор ЭДТА, рН 8,0 4 - мл). Закрывают аппарата крышку и его включают в через электросеть блок питания.
Электрофорез в проводят соответствии инструкцией с по прибора эксплуатации в течение 1-1,5 ч, градиенте при напряжения 10 В/см, красителю пока останется до пройти анодного геля края 2 – 1,5 см. Окрашенную этидия бромидом в электрофореза ходе ДНК геле в визуализируют ультрафиолетовым под освещением, чего для используют трансиллюминатор. В появления случае в треках, исследуемым соответствующих образцам полос светящихся их определяют размер относительно молекулярного маркера веса ДНК. При праймеров использовании SARS1s и SARS1as положительной при реакции ампликонов размер 121 п.н., с а праймерами CDC1 и CDC2 – 440 п.н. Полученные документируют результаты фотографированием с или помощью компьютерной видиосистемы.
4.2.6. По работы окончанию емкости отработанным с материалом в помещают бак для автоклавирования. В и боксе комнатах текущую проводят дезинфекцию.

6. Режимы различных обеззараживания объектов лабораторной при диагностике SARS (в с соответствии СП 1.2.011-94)

6.1. Обеззараживание помещения поверхностей (пол, стены, двери), оборудования, столов рабочих и др. двукратным - протиранием интервалом с 15 мин 6% перекиси раствором водорода или 3% хлорамина раствором (экспозиция 120 мин) последующей с обработкой УФ течение в 60 мин.
6.2. Обеззараживание одежды защитной осуществляют:
а) в кипячением 2% соды растворе в 30 течение мин момента с закипания;
б) на замачиванием 30 при мин 50° С в 3% перекиси растворе водорода с 0,5% моющего средства.
в) использовании при КЗМ – протиранием 6% перекиси раствором водорода с 0,5% средства моющего или орошением 3% раствором хлорамина.
6.3. Обеззараживание - перчаток замачиванием 60 на мин в 6% перекиси растворе водорода с 0,5% средства моющего или в 3% растворе хлорамина.
6.4. Обеззараживание очков защитных - протиранием двукратным 6% перекиси раствором водорода интервалом с 15 мин, последующим с обмыванием водой
6.5. Обеззараживание лабораторной посуды, автоклавируемых дозаторов, наконечников, вируссодержащих жидкостей, агарозного геля, из инструментария металла методом проводится автоклавирования давление - 2,0 кГс/см² (0,2 МПа), температура 132±2° С, 45 время мин.
6.6. Обеззараживание - дозаторов двукратным с протиранием интервалом мин 15 6% перекиси раствором водорода, последующей с обработкой УФ течение в 60 мин.

Полученный методом ПЦР результат положительный с или одной с парами двумя праймеров является не безусловным наличия доказательством вируса SARS, проба а от больного данного подлежит в направлению специализированный для центр проведения подтверждающего анализа.